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恒奥德仪器HAD-V5YX 分光光度计原理操作方法
点击次数:374      更新时间:2023-02-21


  HAD-V5YX 分光光度计原理操作方法

 

 

原理

分光光度计采用个可以产生多个波长的光源,通过系列分光装置,从而产生特定波长的光源,光线透过测试的样品后,分光线被吸收,计算样品的吸光值,从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。

 

单色光辐射穿过被测物质溶液时,被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度(光路长度)成正比,其关系如下式:

 

A=-lg(I/I0)=-lgT=kLc

 

式中 :A 为吸光度;

 

I0为入射的单色光强度;

 

I 为透射的单色光强度;

 

T 为物质的透射率;

 

k 为摩尔吸收系数;

 

L 为被分析物质的光程,即比色皿的边长;

 

c 为物质的浓度;

 

 

蛋白质的直接定量UV法)

 

这种方法是在280nm波长,直接测试蛋白。选择Warburg 公式,光度计可以直接显示出样品的浓度,或者是选择相应的换算方法,将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单,测试空白液,然后直接测试蛋白质。由于缓冲液中存在些杂质,般要消除320nm 背景"信息,设定此能"。与测试核酸类似,要求A280的吸光值至少大于0.1A,佳的线性范围在1.0-1.5 之间。实验中选择Warburg 公式显示样品浓度时,发现读数漂移"。这是个正常的现象。事实上,只要观察A280的吸光值的变化范围不过1%,表明结果非常稳定。漂移的原因是因为Warburg 公式吸光值换算成浓度,乘以定的系数,只要吸光值有少许改变,浓度就会被放大,从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法,适合测试较纯净、成分相对单的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说,速度快,操作简单;但是容易受到平行物质的干扰,如DNA的干扰;另外敏感度低,要求蛋白的浓度较。

 

比色法蛋白质定量

 

蛋白质通常是多种蛋白质的混合物,比色法测定的基础是蛋白质构成成分:氨基酸(如酪氨酸,丝氨酸)与外加的显色基团或者染料反应,产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关,从而反应蛋白质浓度。

 

比色方法

 

般有BCABradfordLowry 等几种方法。

 

Lowry 法:以早期的Biuret 反应为基础,并有所改。蛋白质与Cu2 反应,产生蓝色的反应物。但是与Biuret 相比,Lowry 法敏感性更。缺点是需要顺序加入几种不同的反应试剂;反应需要的时间较长;容易受到非蛋白物质的影响;含EDTATriton x-100ammonia sulfate 等物质的蛋白不适合此种方法。

 

BCABicinchoninine acid assay)法:这是种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的蛋白在碱性溶液里与Cu2 反应产生Cu ,后者与BCA形成螯合物,形成紫色化合物,吸收峰在562nm波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系较强,反应后形成的化合物非常稳定。相对于Lowry法,操作简单,敏感度。但是与Lowry法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。

 

操作方法

1.接通电源,打开仪器开关,掀开样品室暗箱盖,预热10分钟。

 

2.将灵敏度开关调至“1"档(若零点调节器调不到“0"时,需选用较。)

 

3.根据所需波长转动波长选择钮。

 

4.将空白液及测定液分别倒入比色杯3/4处,用擦镜纸擦清外壁,放入样品室内,使空白管对准光路。

 

5.在暗箱盖开启状态下调节零点调节器,使读数盘针向t=0处。

 

6.盖上暗箱盖,调节“100"调节器,使空白管的t=100,针稳定后逐步拉出样品滑竿,分别读出测定管的光密度值,并记录。

 

7.比色毕,关上电源,取出比色皿洗净,样品室用软布或软纸擦净。